[비긴랩 서울캠퍼스] 바이오제약 취업 부트캠프 2주차 후기

안녕하세용 2주차네요 캬캬...
약간의 멘붕의 한 주 였지만 나름 극복을 했답니다. 힘들어하다보니 지나갔음ㅎㅋㅎㅋ

근데 지금 다시 블로그로 복습하려니까 넘 힘들어요
새로운 용어 때문에 복습하느라 주말 다갔네요
아직도 근데 제대로 기억을,, 못해서리,,, 빼먹는 내용 많을 것으로 예상...
빠른시일내에 다시 복습해서 추가추가 할 예정!!

7/14(월) 6일차

오전은
CFU를 위한 cp.cell colony를 배양했어요
그리고 항생제 없는 배지에 living cell 갯수를 파악하고 kan 배지에 competent cell에 플라스미드가 잘 들어갔는지! =transformation 의 colony수 확인하면
효율을 구할 수 있다는 이론 배움 

지난 주 얼려둔 CP.CELL 을 가지고 transformation(DH5α+pET28a-GFP) 했답니다

희석을 해보아요~

열심히 spreading 하는 중..

plasmid는 멘토님이 준비해주신걸로 주입했어요 ->
spreading(DH5α) 기법 잘 기억해둘것-> overnight 배양
seed culture for BL21 cp.cell 하고 집에감 

 

7/15(화) 7일차

DH5α+pET28a-GFP colony 확인했는데
잘 안자라서 오후에 확인하기로 함

CFU:Cell counting 공식적용
OD값과 세포수의 관계
보통 OD600 = 1.0일 때 대장균(E. coli)의 세포 수는 대략: 8 × 10⁸ cells/mL (종류나 배양 조건에 따라 다를 수 있음) * 12ml 사용 / 10(소분한 cp.cell 확인)

근데 제 10^-6 배지는 콜로니가 안자라서 당황쓴,,,,

같은 팀원 것이 잘 나와서 찰칵해줬습니다~


competentcell 제작(BL21) 을 했어요
저희 조가 제일 빨리 시작했고
10:45 시작해서 13:30분에 울 팀 전부 맞췄어용
sw님은 슈퍼박테리아라 그런지 딱 13:00에 OD값 0.444완료 ㅎㅎ BL21이 더 빨리 자랄거라는 우려 때문에 점심시간에 OD값 못맞출 줄 알았지만 ㅎㅎ 데이터의 힘이라고 할까나!!! 지난주에 확인했던 데이터로 실험 진행하니까 그대로 나와줘서 신기했다~~^^

짜으-릿~!

연속으로 competentcell 제작(BL21) 후 10개로 소분

점심시간 전에는 부족할 것 같은 배지들도 오후에 auto clave에 돌릴 수 있게 미리 제작해둠.
 
 오후에 CFU 계산! 구체적인 결론
1. 항생제 없는 plate라면?
 → living cell 있었다는 뜻.
 transformation 됐는지 아닌지는 아직 모름. 유전자 안 들어간 애들도 그냥 자람.
2. 항생제 plate인데 콜로니가 나왔다?
→ 유전자가 들어간 competent cell이 살아남았고, 항생제 내성 유전자도 발현 중!
→ 즉, plasmid 안 들어간 세포는 죽었고, 들어간 애들만 살아남음 → transformation 성공

저는 계산해보니 Living cell 35,424개 중 1개가 transformation 할 수 있다고 결론 나옴,, ㅋㅋ
결론은 딱히 좋은 효율은 아닌걸로 판명 ㅇㅅㅇ


DH5α+pET28a-GFP kan배지의 colony를 따서 다른 kan 고체배지에 subculture했고 동일한 백금이로 kan넣은 액체배지에 transformation seed culture을 했다.

<항생제 넣은 배지를 사용하는 이유>
1. 벡터 유지 유도
대장균은 플라스미드를 잃어버릴 수 있음(성장하면서 필요 없으면 빼버리는 게 있음)

하지만 kanamycin이 있으면? 벡터가 없는 애들은 죽어버림.
결과적으로 벡터를 계속 갖고 있는 애들만 살아남음 → GFP 단백질 발현 유지

2. 비형질전환 균 제거
형질전환이 100% 성공하는 건 아님. 안 된 애들도 섞여 있을 수 있지만 항생제를 넣으면 그런 애들은 생존 불가함

-> 단백질 발현을 위한 준비과정 진행 완료

7/16(수) 8일차

plasmid prep( pET28a-GFP)
전날 항생제가 들어간 LB배지에 주입한 DH5α transfromation seed로 plasmid를 prep하였다.

prep한 plasmid를 가지고 nano drop 기계에서 DNA정량을 확인했는데...
DNA농도가 좀 낮다.. 보통은 20이상이라고 함..
근데 울 조원 ye님은 14가 나왔따..!대박..

그리고 230/280은 괜찮다. 순도는 나쁘지 않은 편이긴 함, 근데 260/230은 낮아서 오염 가능성이 있다고 한다.
추출 과정에서 정제가 덜 됐다고 볼 수 도 있음...

아무튼 nano drop 기계는 굉장히 세심하게 다뤄야하는 기계였다! 정말 미세하게 조작을 잘못해도 오류가 계속 떠서 다시 해야함.. 시간이 오래걸렸던 이슈가 있었다~

nanodrop 결과랍니다
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전기영동 장치 사용법
진행 겔 만드는 법,
주입하는 내용 숙지하기!

이제 nanodrop결과를 통해서
plasmid가 잘 들어있는지 전기영동 장치로
확인해보려고 했답니다

그렇게 해보고나서 확인했는데 제거 또 결과가 띠용했어요ㅜㅜ

DH5α plasmid
밴드가 여러개고 흐리게 보인 이유는?!

DNA 양이 적거나 희석됐을 때...시작 DNA가 너무 적으면 밴드가 약해서 흐릿해 보일 확률이 있을 거 같음

제꺼가 Ladder 담에 3번째거인데 에잇 참,, 선명한 한줄 원해요ㅠㅠ
집가즈아

7/17(목) 9일차

primer design 

MCS: cloning 하기 좋은 site
제한효소

사실 이해를 잘 못해서 울 팀원들 괴롭혔어영....ㅋㅋ물어본거 또 물어보고.. 그래도 답답한 티 안내고 잘 설명해줘서 얼마나 고맙던지 몰라요!
물론 여전히 깊이 이해하긴 어렵지만 그래도 멘토님이 설명해주신거 다시 곱씹어보고 팀원이 얘기해준대로 다시 적용해보니까 주말인 오늘 이해할 수 있었어여...
토요일에는 EBS들어가서 생2 유전자 부분 다시 공부함..ㅠㅠ 힝 그렇게해서라도 이번주에 배운 내용 정확하게 알고 싶었고,,,
아무튼 프라이머에 대해 정확하게 인지할 수 있었답니다!

추출한 plasmid DNA와 BL21 cp.cell transformation

이후 kan 배지에 스프레딩하고 overnight 배양

7/19(금) 10일차

 

배지확인 - colony 확인 완료

PCR이론 (변성, 결합, 증폭)

1. 변성 (Denaturation)
•온도: 92~95℃
•이 온도에서 이중 가닥 DNA가 열려서 단일 가닥으로 풀림

2. 결합 (Annealing)
•온도: 50~65℃ (프라이머에 따라 다름)
•단일 가닥 DNA에 프라이머(primer)가 붙는 단계.
(프라이머는 DNA 복제의 시작점을 찍어주는 짧은 염기 서열임)

3. 증폭 (Extension 또는 Elongation)
•온도: 70~74℃
•Taq polymerase가 프라이머부터 DNA를 쭉 복제함, dNTP(디옥시뉴클레오타이드) 재료 써서 새로운 DNA 가닥 만듦.

pcr에 앞서서 필요한 것들, DNA (template), Primer, Taq Polymerase, Taq Buffer, dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 공부함.

PCR진행
DNA (template) 없으면 복제할 DNA가 없음 -> 잘 넣음
• Primer 없으면 DNA 복제 시작점이 없음 -> 넣음
• Taq Polymerase 없으면 중합 반응 자체가 안됨 -> 넣음
• Taq Buffer 없으면 효소가 제대로 활성화 못함 -> 여기서 용량이 매우 적었는데 넣었는지 기억이 안남..

• dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 없으면 새로운 DNA 염기쌍을 못 만듦 ->
넣었는지 긴가민가함..
용량이 너무 적어서 피펫질을 제대로 한건지도 안보였는데 진짜 안들어간 모양,,

GFP증폭을 위한 PCR프로그램 실행완료! 결과는?
뚜둥

두번째 텅빈 사람 누구냐? 나다...ㅠ
3,4,6이 진짜 잘한거라고 해요..!!!
발현하다 못해 넘치는 장면,,,,

어쨋든 그래도 BL21 항생제 배지에 colony가 떴다는건.. plasmid가 있다는 뜻으로 해석했는데
(사실 아닐수도ㅠㅠ)
제발 제발 저 위에 과정에서 용액을 잘 못넣었다고 해줘,,,,ㅠ 아무래도 중합효소인듯ㅎㅎ

쿨한 척했지만,,, 넘 아까웠음 ㅎㅎ 피펫 연습 잘해야겠다
다음 PCR은 잘하는걸로^^
저도 Purification하고싶어여~!!!

 

	마지막 먹부림짤쓰 춘리마라탕 조여사네 부대찌개, 순두부찌개 초밥가게 모밀정식 일미집 감자탕

ㅋㅋ점심마다 먹은것들도 기록,,,,,,
독산 맛집 뿌셔뿌셔😎 
나 밥먹으러 학원오는것 같아,, 앞으로도 생각 많이 날듯ㅋㅅㅋㅋㅅㅋ
ㅋㅋㅋㅋㅋㅋ요새 입맛이 없는데 다들 잘먹어서 그런지 덩달아서 입맛 좋아짐ㅋㅋㅋ
살찌는 것 빼곤 좋음ㅎㅎ

다음주도 잘먹고 열공합시다요!